En créant, en 1498, quatre postes de Régents rémunérés sur le Trésor Royal, le roi Louis XII transformait l’Université médicale de Montpellier en Collège Royal de Médecine placé sous sa dépendance. Cette structure, plus moderne, se développa fortement sous le règne d’Henri IV, qui permit l’éclosion de nouvelles disciplines, dont la chaire d’anatomie et botanique, et plus tard celle de chirurgie et pharmacie, et créa le Jardin Botanique Royal en 1593.
Le médecin naturaliste Guillaume Rondelet, Chancelier du Collège Royal, domine de sa haute stature le XVIe siècle ; il imprima un remarquable développement à l’anatomie (il fit construire le premier amphithéâtre d’anatomie de France), à la zoologie et à la botanique. François Rabelais fut le plus célèbre élève du Collège Royal à cette époque.
Le XVIIe siècle vit l’émergence d’une nouvelle discipline, la chimie, pour laquelle furent créés une chaire et un laboratoire. On commença à ré-enseigner la chirurgie grâce à Pierre Chirac. Quant au Chancelier François Ranchin, il fit totalement restaurer les locaux vétustes du Collège Royal, dans la rue Saint-Mathieu, ancienne rue du bout-du-mont.
Alors qu’au XVIIe siècle dominaient deux écoles de pensée médicales extérieures (iatrochimistes et iatromécanistes), le Collège Royal de Médecine de Montpellier domina la Médecine française au XVIIIe siècle. Ses professeurs étaient les médecins des rois et d’actifs contributeurs de l’Encyclopédie de Diderot et d’Alembert. Leurs idées dominèrent le monde médical de l’époque, et l’un d’entre eux, Paul-Joseph Barthez, développa le vitalisme, une nouvelle théorie médicale qui eut une large diffusion dans toute l’Europe.